Analysis of the immunomodulatory properties of mycobacterium cell wall fraction on the cytokine production of peripheral blood mononuclear cells of healthy dogs

Hintergrund: Mycobakterieller Zellwandbruch (MCWF) stammt von nicht pathogenem Mycobacterium phlei und wird als immunmodulatorischer Bestandteil in der klinischen Praxis eingesetzt, wobei seine Wirkungsweise weiterer Aufklärung bedarf. ZIEL: Eine Evaluierung der Wirtantwort auf MCWF in caninen peripheren Blut Mononuklearzellen (PBMCs) mittels Enzyme‐linked Immunosorbent Assays (ELISA) und einem quantitativen real‐time (qRT)‐PCR zur Bestimmung von Zytokinen.

Tiere: Acht gesunde Labrador Retriever.

Materialien und methoden: PMBCs wurden mittels Dichtegradienten‐Zentrifugation aus Vollblut isoliert. Die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von MCWF oder mit einem potenten Stimulator der Zytokinproduktion, nämlich Phorbol 12‐Myristate 13‐Acetate/Ionomycin, kultiviert oder für 24, 48 und 72 h im Kulturmedium belassen. Die Zytokine Interleukin (IL)‐4, IL‐10 und Interferon‐Gamma (IFN‐γ) wurden mittels ELISA bestimmt und IL‐4, IL‐10, IL‐13, IFN‐γ, Tumornekrosefaktor‐alpha (TNF‐α) und Transforming Growth Factor‐beta mittels qRT‐PCR.

Ergebnisse: Eine signifikante Zunahme der IL‐10 Messenger (m)RNA wurde zu allen Zeitpunkten für alle MCWF‐Konzentrationen festgestellt (p < 0.05). Die Proteinanalyse bestätigte dieses Ergebnis bei einer maximalen IL‐10 Konzentration von 300.6 ± 38.3 μg/mL, was auf die Fähigkeit einer regulatorischen Wirkung hinweist. Im Vergleich zur Negativkontrolle wurde nach der Stimulation eine Erhöhung der IFN‐γ mRNA nach 24 h bei allen MCWF‐Konzentrationen gefunden (p < 0.01) während festgestellt wurde, dass TNF‐α mRNA nur bei 0.5 μg/dL MCWF nach 72 h erhöht war (p < 0.05).

Schlussfolgerungen und klinische bedeutung: Die Stimulation von PBMCs mittels Mycobakteriellem Zellwandbruch resultiert in einer Erhöhung sowohl der proinflammatorischen wie auch der regulatorischen Zytokin mRNA. Weitere Studien über die Rolle der MCWF als systemisch verabreichter regulatorischer Immunmodulator oder als Adjuvans bei Allergen‐spezifischer Immuntherapie sollte bedacht werden.

背景: 分枝杆菌细胞壁成分 (MCWF) 源自无致病性的草分枝杆菌，在临床中用作免疫调节化合物，但其作用方式需要进一步研究。 目的: 使用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和定量实时 (qRT)‐PCR 评估细胞因子，评估犬外周血单核细胞 (PBMC) 中宿主对 MCWF 的反应。 动物: 八只健康的拉布拉多猎犬 材料和方法: 使用密度离心法从全血中分离 PBMC。将细胞与不同浓度的 MCWF 或强效的细胞因子产生刺激剂佛波醇 12‐肉豆蔻酸酯 13‐乙酸酯/离子霉素一起培养，或留在细胞培养基中 24、48 和 72 小时。通过 ELISA 测量细胞因子的白细胞介素 (IL)‐4、IL‐10 和干扰素‐γ (IFN‐γ)，并通过 qRT‐PCR 测量 IL‐4、IL‐10、IL‐13、IFN‐γ、肿瘤坏死因子 α (TNF‐α) 和转化生长因子‐β。 结果: 在所有时间点，在所有浓度的 MCWF 中均检测到 IL‐10 信使 (m)RNA 显著增加 (p < 0.05)。蛋白质分析反映了这一发现，最大 IL‐10 浓度为 300.6 ± 38.3 μg/mL，表明具有调节作用的潜力。与阴性对照相比，在 24 小时后，所有浓度的 MCWF 均观察到 IFN‐γ mRNA 刺激后升高(p < 0.01)，而 0.5 μg/dL MCWF 仅在 72 小时后 TNF‐α mRNA 升高(p < 0.05)。 结论和临床意义: PBMCs 的分枝杆菌细胞壁成分刺激会导致促炎和调节性细胞因子 mRNA 升高。应考虑进一步研究 MCWF 作为全身给药调节性免疫调节剂或过敏原特异性免疫疗法佐剂的作用。.

Contexte: La fraction de paroi cellulaire de Mycobacterium (MCWF) est dérivée de Mycobacterium phlei non pathogène et est utilisée comme composé immunomodulateur en pratique clinique, mais son mode d'action nécessite des recherches supplémentaires.

Objectif: Évaluer la réponse de l'hôte à la MCWF dans les cellules mononucléaires du sang périphérique canin (PBMC) en utilisant des tests immuno‐enzymatiques (ELISA) et la PCR quantitative en temps réel (qRT) pour l'évaluation des cytokines.

Animaux: Huit Labrador retrievers en bonne santé MATÉRIELS ET MÉTHODES: Les PBMC ont été isolés à partir du sang total par centrifugation de densité. Les cellules ont été mises en culture avec différentes concentrations de MCWF ou avec un puissant stimulateur de la production de cytokines, le phorbol 12‐myristate 13‐acétate/ionomycine, ou laissées dans un milieu de culture cellulaire pendant 24, 48 et 72 heures. Les cytokines ont été mesurées par ELISA pour l'interleukine (IL)‐4, l'IL‐10 et l'interféron‐gamma (IFN‐γ), et par qRT‐PCR pour l'IL‐4, l'IL‐10, l'IL‐13, l'IFN‐γ, le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF‐α) et le facteur de croissance transformant‐bêta. RÉSULTATS: Une augmentation significative de l'ARN (m) messager de l'IL‐10 a été détectée à tous les points dans le temps pour toutes les concentrations de MCWF (p < 0.05). L'analyse des protéines a reflété cette découverte, avec une concentration maximale d'IL‐10 de 300.6 ± 38.3 μg/mL, indiquant la possibilité d'un effet régulateur. Par rapport au contrôle négatif, l'élévation post‐stimulation de l'ARNm de l'IFN‐γ a été notée à 24 h avec toutes les concentrations de MCWF (p < 0.01), et l'ARNm du TNF‐α a augmenté pour le MCWF de 0.5 μg/dL seulement à 72 h (p < 0.05).

Conclusions et pertinence clinique: La stimulation des PBMC par la fraction de paroi cellulaire de Mycobacterium entraîne une augmentation de l'ARNm des cytokines pro‐inflammatoires et régulatrices. Il convient d'envisager des recherches supplémentaires sur le rôle de la MCWF en tant qu'immunomodulateur régulateur administré par voie systémique ou en tant qu'adjuvant de l'immunothérapie spécifique à l'allergène.

背景: マイコバクテリウム細胞壁画分(MCWF)は、非病原性マイコバクテリウム(Mycobacterium phlei)由来の画分であり、臨床において免疫調節化合物として使用されているが、その作用機序についてはさらなる研究が必要である。 目的: 本研究の目的は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)および定量的リアルタイム(qRT)‐PCRを用いたサイトカインの評価により、イヌ末梢血単核球(PBMC)におけるMCWFに対する宿主応答を評価することであった。 供試動物: 健常ラブラドール・レトリバー8頭 材料と方法: PBMCを密度遠心法により全血から分離した。この細胞を、異なる濃度のMCWF、またはサイトカイン産生の強力な刺激因子であるフォルボール12‐ミリスチン酸13‐アセテート/イオノマイシンとともに、あるいは細胞培養液中に24、48、72時間放置して培養した。サイトカインは、インターロイキン(IL)‐4、IL‐10、インターフェロン‐γ(IFN‐γ)についてはELISA法で、IL‐4、IL‐10、IL‐13、IFN‐γ、腫瘍壊死因子α(TNF‐α)、トランスフォーミング増殖因子βについてはqRT‐PCR法で測定した。 結果: IL‐10メッセンジャー(m)RNAの有意な増加が、すべてのMCWF濃度においてすべての時点で検出された(p < 0.05)。タンパク質分析もこの所見を反映し、IL‐10の最大濃度は300.6 ± 38.3 μg/mLであり、調節作用の可能性を示した。陰性対照と比較して、IFN‐γ mRNAの刺激後の上昇は、すべての濃度のMCWFで24時間後に認められ(p < 0.01)、TNF‐α mRNAは0.5μg/dLのMCWFでのみ72時間後に上昇した(p < 0.05)。 結論と臨床的意義: PBMCのマイコバクテリウム細胞壁画分刺激は、炎症性サイトカインおよび制御性サイトカインのmRNAの上昇をもたらした。全身投与される調節性免疫調節因子またはアレルゲン特異的免疫療法のアジュバントとしてのMCWFの役割について、さらなる研究を検討すべきであった。.

Contexto: A fração da parede celular de Mycobacterium (MCWF) é derivada de Mycobacterium phlei não patogênico e é usada como um composto imunomodulador na prática clínica, mas seu modo de ação requer mais pesquisas.

Objetivo: Avaliar a resposta do hospedeiro ao MCWF em células mononucleares do sangue periférico canino (PBMCs) usando ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e PCR quantitativa em tempo real (qRT) para avaliação de citocinas.

Animais: Oito labrador retrievers saudáveis. MATERIAIS E MÉTODOS: PBMCs foram isoladas do sangue total usando centrifugação de densidade. As células foram cultivadas com diferentes concentrações de MCWF ou um potente estimulador da produção de citocinas, forbol 12‐miristato 13‐acetato/ionomicina, ou armazenadas em meio de cultura celular por 24, 48 e 72 h. As citocinas interleucina (IL)‐4, IL‐10 e interferon‐gama (IFN‐γ) foram medidas por ELISA, e IL‐4, IL‐10, IL‐13, IFN‐γ, fator de necrose tumoral alfa (TNF‐α) e fator de crescimento transformador‐beta por qRT‐PCR.

Resultados: Um aumento significativo do mRNA da IL‐10 foi detectado em todos os pontos de tempo experimental para todas as concentrações de MCWF (p < 0.05). A análise de proteínas refletiu essa descoberta, com uma concentração máxima de IL‐10 de 300.6 ± 38.3 μg/mL, indicando o potencial para um efeito regulatório. Comparado ao controle negativo, a elevação pós‐estimulação do mRNA de IFN‐γ foi observada em 24 h com todas as concentrações de MCWF (p < 0.01), e o mRNA de TNF‐α foi aumentado para 0.5 μg/dL de MCWF apenas em 72 h (p < 0.05). CONCLUSÕES E RELEVÂNCIA CLÍNICA: A estimulação de PCMBs pela fração da parede celular de Mycobacterium de PBMCs resultou na elevação do mRNA de citocinas pró‐inflamatórias e reguladoras. Mais pesquisas sobre a função do MCWF como um imunomodulador regulador administrado sistemicamente ou adjuvante à imunoterapia específica para alérgenos devem ser consideradas.

INTRODUCCIÓN: La fracción de pared celular de Mycobacterium (MCWF) se deriva de Mycobacterium phlei no patógeno y se utiliza como un compuesto inmunomodulador en la práctica clínica, aunque su modo de acción requiere más investigación.

Objetivo: Evaluar la respuesta del huésped a MCWF en células mononucleares de sangre periférica canina (PBMC) mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT) para la evaluación de citoquinas.

Animales: Ocho perros labradores retriever sanos MATERIALES Y MÉTODOS: Las PBMC se aislaron de sangre completa mediante centrifugación de densidad. Las células se cultivaron con diferentes concentraciones de MCWF o un potente estimulador de la producción de citoquinas, forbol 12‐miristato 13‐acetato/ionomicina, o se dejaron en un medio de cultivo celular durante 24, 48 y 72 h. Las citoquinas se midieron mediante ELISA para interleuquina (IL)‐4, IL‐10 e interferón‐gamma (IFN‐γ), y mediante qRT‐PCR para IL‐4, IL‐10, IL‐13, IFN‐γ, factor de necrosis tumoral alfa (TNF‐α) y factor de crecimiento transformante beta.

Resultados: Se detectó un aumento significativo del ARN mensajero (m) de IL‐10 en todos los puntos temporales para todas las concentraciones de MCWF (p < 0.05). El análisis de proteínas reflejó este hallazgo, con una concentración máxima de IL‐10 de 300.6 ± 38.3 μg/mL, lo que indica el potencial de un efecto regulador. En comparación con el control negativo, se observó una elevación del ARNm de IFN‐γ después de la estimulación a las 24 h con todas las concentraciones de MCWF (p < 0.01), y el ARNm de TNF‐α aumentó para 0.5 μg/dL de MCWF solo a las 72 h (p < 0.05). CONCLUSIONES Y RELEVANCIA CLÍNICA: La estimulación de PBMCs con la fracción de la pared celular de Mycobacterium da como resultado la elevación del ARNm de citoquinas proinflamatorias y reguladoras. Se debe considerar la realización de más investigaciones sobre el papel del MCWF como inmunomodulador regulador o adyuvante de la inmunoterapia de alérgenos administrado sistémicamente.