Objective: to assess mutational events in exons 5, 7, and 8 of the p53 gene and to reveal mutant p53 protein in verified cases of morphologically altered (proliferative and precancerous changes, lung cancer) and histologically unaltered, lung tissues in workers exposed to occupational radiation.
Material and methods: The investigation used formalin-fixed paraffin-embedded unaltered and altered lung tissue blocks (FFPBs) obtained from the human radiobiological tissue repository. The shelf-life of FFPBs was 5-31 years. An immunohistochemical technique using mouse antibodies against p53 protein (<<DAKO>>, Denmark), stained with diaminobenzidine (DAB) chromogen, was employed to determine p53 protein. DNA was isolated from lung tissue FFPBs with QIAmp DNA FFPE Tissue Kit, (<<QIAGEN>>, USA). Polymerase chain reaction (PCR) was performed to amplify the p53 gene exons 5, 7, and 8 selected for examination, by applying the sequences of genes and primers, the specificity of which was checked using the online resource (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). PCR products were detected by temporal temperature gradient gel-electrophoresis and the Sanger sequencing method. The obtained DNA fragments were analyzed on a sequencer ABI Prism 3100 Genetic Analizer (<<Applied Biosystems>>, USA). Computer-aided DNA analysis was made using the BLAST program. A package of applied Statistica 6.0 programs was employed for statistical data processing. Results. Immunohistochemical analysis showed that mutant p53 protein was absent in the cells of unaltered lung tissue and the number of cells with mutant p53 protein increased in all the patients with proliferative and precancerous changes and lung cancer, suggesting p53 protein dysfunction. The total number of p53 gene mutations in exons 5, 7, and 8, if there were proliferative and precancerous lung tissue changes and lung cancer, were 25, 20, and 40%, respectively. All the found mutations were transversions (the substitution of purine for pyrimidine or, conversely), indicating the action of exogenous mutagens.
Conclusion: The results of this investigation have confirmed other investigators' data showing that p53 gene mutations in lung cancer are observed in 40-70% of cases. The differences in the number of cases of altered lung tissue with mutations in the p53 gene (not more than 40%) and in those of p53 protein expression were found in 100%, suggesting the regulation of p53 gene function in the cell at multiple levels.
Цель исследования - оценка мутационных событий в 5, 7 и 8-м экзонах гена р53 и выявление мутантного белка р53 в морфологически верифицированных случаях измененной (пролиферативные и предопухолевые изменения, рак легкого), а также гистологически неизменной ткани легкого работников, подвергшихся профессиональному облучению. Материал и методы. Для исследования использованы фиксированные в формалине парафиновые блоки (ФФПБ) неизмененной и измененной ткани легкого, полученные из радиобиологического репозитория тканей человека (РРТЧ). Срок хранения ФФПБ составлял 5-31 год. Для определения белка р53 применяли иммуногистохимический метод с использованием мышиных антител к протеину р53 ('DAKO', Дания) и окраской диаминобензидин (ДАБ)-хромогеном. ДНК и ФФПБ ткани легкого выделяли с помощью набора QIAmp DNA FFPE Tissue Kit ('QIAGEN', США). Полимеразную цепную реакцию для амплификации выбранных для изучения 5, 7 и 8-го экзонов гена р53 проводили используя последовательности генов и праймеров, специфичность которых проверена с помощью онлайн-ресурса (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Детекцию продуктов реакции ПЦР осуществляли с помощью метода гельэлектрофореза при временном градиенте температуры (TTGE) и метода секвенирования по Сэнджеру. Анализ полученных фрагментов ДНК осуществляли на секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer ('Applied Biosystems', США). Компьютерный анализ ДНК проводили с использованием программы BLAST. Для статистической обработки данных использовали пакет прикладных программ Statistica 6.0. Результаты. Иммуногистохимический анализ показал отсутствие мутантного белка р53 в клетках неизмененной ткани легкого и увеличение количества клеток с мутантным белком р53 у всех больных при пролиферативных и предопухолевых изменениях и при раке легкого, что свидетельствовало о нарушении функции белка р53. Общее количество мутаций гена р53 в экзонах 5, 7 и 8 при пролиферативных и предопухолевых изменениях ткани легкого и раке легкого составило 25, 20 и 40% соответственно. Все обнаруженные мутации были трансверсиями (замена пурина на пиримидин или наоборот), что указывало на воздействие экзогенных мутагенов. Заключение. Результаты настоящего исследования подтвердили данные других исследователей, что мутации гена р53 при раке легкого наблюдаются в 40-70% случаев. Различия в числе случаев измененной ткани легкого с мутациями гена р53 (не более 40%) и в числе с экспрессией белка р53, обнаруженные в 100%, свидетельствуют о многоуровневой регуляции функции гена р53 в клетке.