DNA repair is a most important cellular process that helps maintain the integrity of the genome and is currently considered by researchers as one of the factors determining the maximum lifespan. The central regulator of the DNA repair process is the enzyme poly(ADP-ribose)polymerase 1 (PARP1). PARP1 catalyzes the synthesis of poly(ADP-ribose) polymer (PAR) upon DNA damage using nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) as a substrate. This polymer covalently attaches to PARP1, which leads to its dissociation from the complex with damaged DNA and stimulation of the repair process. Despite intensive research on PARP1, its properties as an isolated protein have not been practically studied in mammals that demonstrate a long maximum lifespan, such as, for example, the naked mole rat (Heterocephalus glaber). High activity of DNA repair systems is observed in the cells of the naked mole rat, which ensures their high resistance to oxidative stress, as well as to genotoxic effects. The revealed features may be due to the high activity of PARP1 in the cells of the naked mole rat; however, this issue remains poorly understood and, thus, requires more detailed research, including one with the use of isolated protein PARP1 of the naked mole rat, the isolation and characterization of which have not been carried out before. In the present work, the amino acid sequence of PARP1 of the naked mole rat is compared with the amino acid sequences of orthologous proteins of other mammals. In contrast to human PARP1, 13 evolutionarily conservative amino acid substitutions in various functional domains of the protein have been identified in the amino acid sequence of naked mole rat PARP1. Using the cDNA of the naked mole rat's Parp1 gene, a vector was created for the expression of the target protein in Escherichia coli cell culture. For the first time, a detailed description of the procedure for the expression and purification of the recombinant protein PARP1 of the long-lived naked mole rat is presented. In addition, poly(ADP-ribose)polymerase activity of the obtained protein was evaluated. The results presented in this paper are the basis for further detailed characterization of the properties of purified recombinant naked mole rat PARP1.
Репарация ДНК – важнейший клеточный процесс, который способствует поддержанию целостности генома. В настоящее время эффективная работа систем репарации ДНК рассматривается исследователями как один из ключевых факторов, определяющих максимальную продолжительность жизни. Центральным регулятором процесса репарации ДНК является фермент поли(ADP-рибоза)полимераза 1 (PARP1), способный синтезировать полимер поли(ADP-рибозы) (PAR) в ответ на повреждение ДНК и присоединять его к белкам- мишеням, в число которых входит и сам PARP1, осуществляя тем самым посттрансляционную модификацию этих белков и регулируя их сродство к ДНК. PARP1 принимает участие и во многих других процессах, ассоциированных с клеточным старением, таких как поддержание целостности теломер и развитие воспалительной реакции. Свойства PARP1 как изолированного белка практически не исследовались у млекопитающих, кото- рые демонстрируют высокую максимальную продолжительность жизни, за исключением человека. Одним из перспективных объектов таких исследований считается голый землекоп (Heterocephalus glaber), имеющий экстремально высокую максимальную продолжительность жизни, а также более эффективно функционирую- щие системы репарации ДНК, которые обеспечивают высокую устойчивость его клеток к воздействию ряда генотоксических агентов, по сравнению с другими мелкими грызунами, например, близкой по размеру и массе тела мышью (Mus musculus). В настоящей работе проведено сравнение аминокислотной последовательности PARP1 голого землекопа с аминокислотными последовательностями белков-ортологов других млекопитаю- щих. В отличие от PARP1 человека, в аминокислотной последовательности PARP1 голого землекопа выявлено 13 эволюционно консервативных аминокислотных замен в различных функциональных доменах белка. С ис- пользованием поиска в базах данных последовательности кДНК гена Parp1 голого землекопа и последующего анализа путем выравнивания транскриптомных данных выбрана соответствующая экспрессируемому варианту Parp1 последовательность кДНК, которая была клонирована с помощью экспрессионного вектора на основе плазмиды pLate31. В результате экспрессии в штамме Escherichia coli BL21(DE3)GeneX и очистки, проведенной с использованием трех хроматографических стадий, впервые был получен и охарактеризован функционально активный фермент PARP1 голого землекопа.
Keywords: DNA repair; Heterocephalus glaber; poly(ADP-ribose)polymerase 1.
Copyright © AUTHORS.