Diferencia entre revisiones de «Carga viral»
Contenido eliminado Contenido añadido
Sin resumen de edición |
m mejoras menores y uso de sinónimo para no repetir tanto mismo adjetivo. |
||
| (No se muestran 7 ediciones intermedias de 7 usuarios) | |||
Línea 1:
'''Carga viral''' o '''carga vírica''' es la
La carga viral se usa para control terapéutico de virosis crónicas y control de pacientes inmunosuprimidos como los que han recibido [[trasplante (medicina)]] de órganos o de [[células madre]] hematopoýeticas o de [[médula ósea]].
Línea 8:
En el diagnóstico y tratamiento del [[Virus de la inmunodeficiencia humana|VIH]] la carga viral es la cuantificación de VIH-1 que se encuentra en el [[Plasma sanguíneo|plasma]] o cuantificación del [[ARN|RNA]] vírico que existe en una muestra. El método empleado consiste en técnicas de [[biología molecular]] o de diagnóstico genético, usando la [[reacción en cadena de la polimerasa]].
La determinación de la carga viral plasmática (CV) del VIH es el marcador de respuesta al tratamiento [[antirretroviral]] más sensible, rápido y fiable. La CV se correlaciona directamente con el pronóstico clínico, el riesgo de transmisión viral y el recuento de [[CD4]]. Es una herramienta básica en el manejo clínico de la persona [[seropositivo|seropositiva]] ya que permite:
Línea 21:
== Carga viral en hepatitis B y C ==
Junto con [[Genotipado|genotipificación]] viral, la detección cuantitativa de
Para el
La respuesta al tratamiento
En caso del VHB la carga
Los métodos más utilizados para
== Carga viral de citomegalovirus ==
La cuantificación viral del [[citomegalovirus]] ([[CMV]]) se recomienda para control y tratamiento de pacientes [[inmunodeficiencia|inmunodeficientes]], como quienes padecen el [[síndrome de inmunodeficiencia adquirida]] o quienes reciben medicamentos [[inmunosupresor]]es como parte de su tratamiento con [[trasplante (medicina)]]s y en los cuales el citomegalovirus puede producir serias complicaciones, como una afección [[oportunista]], que ocasiona mayores tasas de [[morbilidad]] y [[mortalidad]]. La carga viral se requiere para monitorización de la [[medicina preventiva|profilaxis]] y del tratamiento preventivo o curativo con medicamentos [[antivirales]] que se recomienda en los casos de trasplante, dado que el CMV es el [[agente patógeno]] más importante que afecta los casos de [[trasplante]] por su correlación directa con el rechazo del [[injerto]] u [[trasplante|órgano trasplantado]]. Se recomienda su realización semanal, al menos mientras el paciente permanezca ingresado.<ref>Rosario, Vicente y Montero, Rafael. ''Tratado de trasplantes de órganos''. Volumen 2. Arán Ediciones, 2006. ISBN 84-95913-77-1, 9788495913777</ref><ref>Llamas Fuentes,Francisco et al. Citomegalovirus en el trasplante renal. ''Archivos de Medicina'', 2006; ''2''(6). [https://web.archive.org/web/20110828051937/http://archivosdemedicina.com/ojs/index.php/archmed/article/viewFile/0020601/68]</ref>
Igualmente la carga viral existente en [[líquido amniótico]] es un factor predictivo de la transmisión intrauterina, y los niños con infección congénita sintomática excretan más virus en la orina que los que tienen una infección asintomática, aunque todavía no se ha podido relacionar la carga
Las técnicas usadas para determinar la carga viral de CMV son las técnicas de la PCR cuantitativa o [[PCR en tiempo real]] y las de [[inmunoensayo]].
== Cuantificación de carga viral ==
Existen diferentes técnicas para poder cuantificar la carga
Todos estos sistemas (a excepción de la
Además, es muy importante tener en cuenta la existencia de diferentes cepas de un mismo microorganismo. Esto implica que un sistema puede ser más [[sensible]] a una cepa que otro y, por tanto, más recomendable.
Línea 95:
:1º paso: el oligo b- (constituido por el cebador y el promotor de T7) se una a su secuencia complementaria específica presente en el extremo del ARN (o ADN) del virus que deseamos estudiar y detectar. (Suponemos obviamente que el virus está presente en la muestra, ya que en caso contrario no se produciría el proceso NASBA de amplificación).
:2º paso: la enzima retrotranscriptasa sintetiza un ADN complementario a la secuencia inicial de ARN diana mediante la elongación del cebador b-.
:3º paso: la enzima
:4º paso: el oligo a+ se une a la hebra de ADN mediante hibridación.
:5º paso: la enzima retrotranscriptasa elonga el oligo, creando otra cadena de ADN. Por tanto tenemos un ADN de doble cadena unido a un promotor T7P en uno de sus extremos.
Línea 115:
'''Electroquimioluminiscencia (ECL)''': se emplea el producto final del proceso NASBA para cuantificar. Para ello junto a la muestra de partida sobre la que realizamos NASBA, se añaden tres calibradores internos cuya secuencia es idéntica a la diana objeto de nuestro estudio salvo en 20 pares de bases que serán específicos de cada uno de ellos. Estos calibradores se encontrarán a unas concentraciones conocidas previamente: baja, media y alta respectivamente. Tras los sucesivos pasos de amplificación, y una vez terminado el proceso, la máquina que ha realizado el NASBA automáticamente dividirá la muestra en cuatro fracciones: diana, calibrador a baja concentración, calibrador a concentración media y calibrador a elevada concentración. Cada una de estas fracciones amplificadas hibridará con una sonda complementaria a los 20 pares de bases diferentes de cada amplicón. Dichas sondas contienen adheridas esferas magnéticos con estreptavidina. Las esferas se encuentran unidas a un electrodo, y a esta mezcla se añade otras sondas inespecíficas con ruterio, que también hibridarán con la secuencia amplificada. Una descarga eléctrica disparará la reacción de electroquimioluminiscencia, desprendiéndose una luz proporcional al número de copias iniciales de la secuencia diana. Comparando el resultado de la secuencia diana con los tres controles cuya concentración nos era conocida seremos capaces de obtener la carga viral inicial.
'''[[Balizas moleculares]] u oligobalizas''': este método permitirá cuantificar a tiempo real. A la mezcla inicial de reacción se han de añadir unas sondas específicas denominadas balizas moleculares (''Molecular beacon'' en inglés). Se tratan de unas secuencias con extremos complementarios entre sí de unos 5 pares de bases, pero que no son complementarios a la secuencia diana. Unido a uno de los extremos presentan un fluorocromo, mientras que en el extremo opuesto hay una molécula que inhibe al fluorocromo cuando está próximo a
Por tanto, cuando no exista secuencia diana con la que puedan hibridar, los extremos complementarios hibridarán entre sí y el fluorocromo estará inactivo. Pero cada vez que NASBA pase por el paso 6º o 12º las balizas moleculares se unirán a las secuencias complementarias del ARN diana amplificadas, separándose sus extremos y quedando liberado el fluorocromo, que emitirá una fluorescencia proporcional al número de hebras de ARN. Esto posibilita la cuantificando de la carga viral en cada uno de los ciclos.
Línea 127:
Se emplean dos tipos de [[sonda molecular|sonda]]:
* '''Sonda señalizadora''': se diseña partiendo de la estructura de ARN metaestable que reconoce la enzima Qβ replicasa. En esta estructura de ARN se clona una secuencia complementaria a la diana buscada (se unirá una sonda señalizadora por molécula de genoma
* '''Sonda de captura''': se diseña una secuencia complementaria a la diana, con un extremo poliG.
Línea 170:
=== Otros métodos ===
Además de las técnicas ya citadas,
* ''Ensayos de captura de híbridos.
Línea 176:
:Para esta técnica, el ADN diana que pueda contener la muestra a analizar es purificado y se une con una sonda de ARN de cadena sencilla (sería necesario desnaturalizar previamente el ADN diana). El híbrido ADN-ARN forma una estructura característica que es reconocida por anticuerpos específicos (dobles cadenas de ADN o cadenas sencillas de ARN no son reconocidas). Estos anticuerpos están fijados a pocillos de placas [[Placa microtituladora|microtituladoras]], de manera que capturan el híbrido ADN-ARN (lo cual también facilita los procesos de lavado durante el ensayo). Los híbridos capturados se detectan añadiendo anticuerpos anti-híbrido ADN-ARN conjugados con [[fosfatasa alcalina]]. Se añade sustrato para la fosfatasa alcalina y se mide la [[quimioluminiscencia]].
:El ensayo de captura de híbridos es por tanto un método de amplificación de señal, ya que no se amplifica la cantidad de ADN diana, sino que
* ''Amplificación basada en digestión.
:Esta técnica permite detectar el ácido nucleico de interés mediante el uso de varias sondas que se unen de forma superpuesta a la diana. Es importante el papel de la enzima bacteriana Cleavase, que reconoce secuencias de
:Para iniciar la amplificación, el ácido nucleico diana se mezcla con '''sonda señalizadora''' y '''sonda invasora'''. Ambas sondas se unen a la diana, con la peculiaridad de que el extremo 5' de la sonda señalizadora se superpone con la sonda invasora. La enzima Cleavase reconoce esta superposición y corta (digiere) la sonda señalizadora, que puede entonces actuar como una sonda invasora en el siguiente paso de la reacción.
Línea 190:
* ''Reacción en cadena de la ligasa'' (''LCR'', en inglés ''Ligase Chain Reaction'').
:La técnica de LCR se basa en la amplificación de sondas-
:En LCR es necesario utilizar un [[termociclador]] para controlar la temperatura de los diferentes pasos:
Línea 203:
:La técnica de SDA consiste en una amplificación que transcurre isotérmicamente, es decir, tras la desnaturalización inicial, la reacción tiene lugar a una misma temperatura. Comprende dos fases:
::- Primera fase ('''generación de la diana'''): el ácido nucleico de la muestra es desnaturalizado por calor (95 °C). En cada extremo de la secuencia diana, un cebador y una sonda hibridan muy cerca el uno del otro. Las sondas contienen un sitio para [[enzima de restricción]]. La extensión del cebador es realizada por una
::- Segunda fase ('''amplificación exponencial de las sondas-diana'''): Cuando se añade la enzima de restricción a la reacción (que contiene ahora sondas de
:El producto de esta amplificación son millones de copias de la sonda original. La adición de sonda fluorescente produce una señal que se corresponde con la cantidad de diana amplificada.
Línea 211:
* ''Sondas [[FRET]].
* ''Círculo rodante.
== Véase también ==
* [[Indetectable = Intransmisible]]
== Referencias ==
| |||