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La '''chromatographie d'adsorption''' est une technique de [[chromatographie]] qui permet de séparer les constituants d’un mélange par entraînement d'analytes au moyen d’une [[phase mobile]] qui peut être liquide ou gazeuse le long d’une phase stationnaire fixe, c'est-à-dire un solide ou un liquide fixé sur un support. Plus les analytes ont une forte affinité avec la phase mobile, plus il y aura d'entraînement. L'absorption fait appel à des liaisons de faible énergie (liaisons hydrogène, Van-der-Waals, liaisons secondaires). L'absorbant le plus utilisé est le gel de silice.
Pour la chromatographie d'adsorption ou dite d’affinité, la phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur présentant une bioaffinité pour une molécule de l’échantillon à analyser.
== Principe ==
La chromatographie d'absorption est une chromatographie avec une phase stationnaire solide avec des propriétés absorbantes et une phase mobile liquide (mélange de solvants possible). La séparation repose sur la répartition des solutés selon la force d'élution de la phase mobile et la force d'absorption de la phase stationnaire. L'équilibre qui en résulte provoque une migration différentielle des solutés de composant l'échantillon à analyser.
Comme toutes les chromatographies, la chromatographie d'affinité permet de séparer les composants d'un mélange, donc de purifier les substances. Pour cela, elle utilise les propriétés des interactions biologiques, donc elle peut purifier un composant en une seule étape. Une matrice insoluble à laquelle est attaché un ligand spécifique de la molécule à purifier et se liant de manière réversible avec celle-ci est utilisée.
== Polarité des solutés ==
Molécule à purifier + ligand spécifique-matrice insoluble {{Grossir|↔|facteur=1.4}} Molécule-ligand-matrice insoluble
La rétention des solutés sur la phase stationnaire dépend des polarités des solutés, de la phase stationnaire et de la phase mobile.
Soluté apolaire : soluté qui n'a aucune charge positive ou négative (exemple de l'hexane H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3).
La molécule d'intérêt se fixe donc à la matrice et les autres composants sont élués. Puis on détache celle-ci de la matrice, ainsi la molécule est purifiée. Pour pouvoir séparer des composants par cette méthode, il faut donc connaître la structure et la spécificité de la molécule d'intérêt afin de choisir un bon ligand, c'est-à-dire que le ligand ne doit pas accrocher d'autres composés que la molécule.
Soluté polaire : soluté chargé. Les molécules polaires s'attirent les uns les autres en présentant à leur voisine leurs pôles électriquement opposés.
[[File:Principe chromatographie.png|thumb|Principe de la chromatographie]]
Exemples :
L'eau est le solvant le plus polaire : l'atome d'oxygène attire à lui l'électron de chacun des deux atomes d'hydrogène qui lui sont liés.
Le 2-propoxyéthanol (molécule moyennement polaire) :
H3C-CH2-CH2-O-CH2-CH2-OH. La chaîne carbonée à gauche de l'atome d'oxygène est apolaire, l'atome d'oxygène forme un pont polaire et la fonction alcool (OH) est polaire.
== Phases stationnaires ou PS (adsorbants) ==
== Méthodologie ==
=== CouplagePropriétés du ligandcommunes ===
*Insoluble dans la phase mobile.
*Inerte chimiquement vis-à-vis des solutés et de la phase mobile.
*Grande surface d'échange pour favoriser la séparation de solutés qui migrent presque à la même vitesse.
*Pouvoir adsorbant important.
=== Nature des adsorbants ===
Pour cela, il faut coupler le [[ligand (chimie)|ligand]] sur une résine à chromatographie qui, en tant que telle, n'a pas d'affinité pour la molécule d'intérêt. Ce couplage doit évidemment se faire sans dénaturer le ligand pour que ce dernier conserve son affinité avec la molécule d'intérêt.
*Adsorbants minéraux (polaires): silice (SiO2), alumine (Al2O3, nH2O), carbonate de calcium (CaCO3), carbonate de magnésium (MgCO3), oxyde de magnésium (MgO)…
*Adsorbants organiques (peu polaires) : [[cellulose]], [[amidon]] (et autres [[Ose|oses]]), Kieselguhr (tests (carapace) de [[Bacillariophyta|diatomées]] broyés)…
== Nature de la phase mobile ou PM ([[éluant|Élution]]) ==
Il existe sur le marché des gels de couplage qui sont des résines préparées à l'avance sur lesquelles est couplé le ligand choisi. Ce sont des résines spécialisées destinées uniquement à cet usage. Elles possèdent en général un groupement chimique facilement activable posé au bout d'un bras écarteur. Diverses résines existent avec divers groupements activables selon la nature chimique du ligand qu'on veut utiliser.
=== Propriétés communes ===
*Insoluble dans la phase stationnaire.
*Inerte chimiquement vis-à-vis des solutés et de la phase stationnaire.
*Pouvoir d'absorption important.
=== Classification des éluants ===
Ce couplage consiste donc à "activer" la résine pour qu'elle puisse former un lien covalent avec le ligand, puis à mettre le ligand en présence de la résine. Il y a ensuite déclenchement de la réaction de formation d'une liaison covalente entre le ligand et la résine afin d'éviter que celui-ci ne se détache et empêche la fixation de la molécule d'intérêt. Enfin, les réactifs résiduels sont éliminés en percolant le gel avec un tampon approprié.
Les éluants sont classés selon leur polarité dans l'ordre croissant (= série éluotropique).
Exemple : cyclohexane → benzène → propanol → eau.
== Interactions entre phase mobile, stationnaire et les solutés ==
=== Adsorption ===
Puisque la chromatographie d'absorption dépend des interactions avec la polarité des phases et des solutés, il est important de trouver des produits avec un compromis entre les trois sources d'interactions.
Exemple de produits pour une CCM ([[Chromatographie sur couche mince]]) :
L'[[adsorption]] consiste à mettre en présence le mélange contenant la molécule d'intérêt et le ligand fixé à la résine dans des conditions favorables à la liaison ligand-molécule spécifique. Les molécules n'ayant pas d'affinité pour le ligand ne se fixeront pas sur la résine et seront éluées, tandis que celles ayant une affinité y resteront attachées.
*PS : gel de silice ;
*PM : cyclohexane + dichlorométane ;
=== Désorption ===
*solutés (du plus au moins retenu) : alcool benzylique, acétophénone, benzophénone, benzaldéhyde, benzoate d'éthyle, acide benzoïque.
La [[désorption]] est pratiquée pour récupérer la molécule d'intérêt fixée à la résine lorsque les autres molécules du mélange sont éluées. Pour cela, le complexe molécule d'intérêt-résine est exposé dans des conditions où l'interaction ligand-molécule spécifique est moins stable.
=== Méthode sur colonne ===
C'est la méthode la plus commune pour adsorber les molécules d'intérêt.
Le mélange ainsi que le solvant servant de phase mobile sont introduits dans la colonne de résine à laquelle le ligand spécifique de la molécule a été préalablement fixé. Donc la molécule d'intérêt reste dans la colonne alors que le reste sort par gravité et flux de solvant. Ensuite, la molécule liée à la résine est éluée en versant un solvant déstabilisant l'interaction ligand-molécule spécifique pour recueillir celle-ci.
La méthode sur colonne s'utilise surtout pour des chromatographies analytiques ou lorsque le mélange à séparer est relativement petit.
=== Méthode en vrac ===
La méthode en vrac ou par agitation consiste à exposer la résine et le mélange à séparer simplement en les brassant ensemble, par exemple dans un bécher avec un agitateur magnétique, durant une période de temps suffisante pour que l'adsorption complète se fasse.
La résine est récupérée, sur laquelle les molécules d'intérêt sont toujours attachées, par simple sédimentation ou, quelquefois, par centrifugation ou filtration pour accélérer le processus. Le "surnageant" ou le "filtrat" contenant le matériel non adsorbé est éliminé, puis la résine est lavée avec le solvant d'adsorption pour enlever les traces résiduelles de contaminants. La molécule d'intérêt peut alors être désorbée, avec un solvant déstabilisant l'interaction ligand-molécule spécifique.
La méthode en vrac est bien adaptée aux chromatographies préparatives où de larges volumes d'un mélange doivent être séparés rapidement sur des résines ayant des débits trop lents en colonne.
=== Détection des effluents ===
Les effluents caractérisent le solvant, les analytes c'est-à-dire les constituants de l'échantillon qui doivent être caractérisés.
Si la colonne est employée pour effectuer la chromatographie d'affinité, il faut suivre alors au fur et à mesure la sortie de la molécule d'intérêt après désorption.
Si la molécule d'intérêt est une protéine, alors l'identification est basée sur le fait que les protéines absorbent dans l'UV et si celles-ci contiennent un acide aminé aromatique comme la tyrosine, phénylalanine et tryptophane, alors un pic d'absorption vers 280 nm peut être observé. C'est pourquoi la quantification des protéines se fait par spectrophotométrie d'absorption à 280 nm.
Si la molécule d'intérêt est un acide nucléique, alors le pic d'absorption se situe vers 254 nm.
== Types de chromatographie d'affinité ==
=== Chromatographie sur colorant ===
Cette technique est aussi appelée chromatographie de pseudo-affinité. Un des colorants utilisés est le bleu de Cibacron.
Il a été démontré que des enzymes se fixent sur le bleu de Cibacron, notamment les déshydrogénases à coenzyme NAD+ de par la ressemblance structurale avec le NAD+ . Donc ce colorant se comporte comme un [[analogue structurel]] de l'ADP, l'AMP, l'ATP et le GTP, ce qui lui permet de retenir des protéines liant des nucléotides. Mais il n'est pas spécifique d'une protéine ce qui ne fait pas un bon ligand pour séparer des protéines liant les nucléotides.
Donc la chromatographie sur colorant ne permet pas de retenir la molécule d'intérêt, mais les composants que le colorant reconnaît, c'est pourquoi cette technique est qualifiée de pseudo affinité.
Cette technique est néanmoins beaucoup utilisée car, même si la molécule d'intérêt n'est pas liée spécifiquement, celle-ci est colorée donc plus pratique à manipuler. Pour séparer la molécule d'intérêt aux autres composants que le colorant reconnait s'ils sont présents dans le mélange, il faut effectuer une autre chromatographie d'affinité avec un ligand spécifique.
=== Chromatographie covalente ===
Cette chromatographie permet de retenir des analytes contenant des groupes [[thiols]] en formant des [[ponts disulfure]].
=== Chélation de métaux immobilisés ===
La [[chelation]] de métaux immobilisés permet de séparer et d'étudier la structure de protéines ayant une affinité pour les ions de métaux lourds.
== Appareillage ==
=== Effecteurs ===
Les effecteurs sont des ligands qui fixent toutes substances capables de former des complexes stables avec des molécules à isoler. Ces substances doivent posséder un groupement réactif assez éloigné du site actif pour que celui-ci reste librement accessible après la fixation.
Chaque domaine possède des effecteurs précis ; c’est pourquoi pour la purification d’enzymes, il est préférable de choisir des substrats et analogues de substrats, des inhibiteurs réversibles, des effecteurs allostériques et des [[coenzyme|coenzymes]]. En immunologie, les [[haptène|haptènes]], les [[anticorps]] et les [[antigènes]] sont les mieux adaptés. Et, enfin, pour les protéines réceptrices, des [[hormones]], des peptides et des analogues de peptides sont utilisés.
=== Supports ===
Les propriétés d’un support sont :
- être insoluble dans l’eau mais mouillable
- être poreux
- être stable chimiquement et mécaniquement
- porter un groupement fonctionnel réactif permettant la fixation des « spacer » (bras fixateur)
Il y a différentes sortes de supports à partir de dérivés de polymères osidiques :
- la carboxyméthylcellulose :
Dans ce dérivé plusieurs sortes de carboxyméthylcelluloses comme la CM-cellulose aminohexylique possèdent un « spacer » (bras espaceur) long permettant d’avoir une certaine distance entre le ligand et le support ce qui réduit la contrainte stérique et facilite la réaction de complexation. Puis, à l’inverse, la CM-cellulose hydrazide qui possède un « spacer » court permettant la fixation d’effecteur ayant une masse molaire élevée. Ces deux dérivés permettent la fixation d’effecteurs portant une fonction carboxyle.
La CM-aminohexylique succinylée et la CM-cellulose aminododécylique sont des supports permettant la fixation des effecteurs portant une fonction –NH2 réactive.
- les sépharoses activées
- le gel de polyacrylamides
=== Facteurs influençant la complexation ligand/molécule d'intérêt ===
Le tampon additionné de substance où le gel est mis en suspension permet de protéger la liaison entre le ligand et le support.
La dimension de la colonne et le volume du lit de gel sont adaptés à la quantité d’échantillon à traiter et à la capacité de rétention du gel.
Le tampon a un pH, une force ionique et une composition définis pour pouvoir réaliser la réaction de complexation. En effet le pH est choisi de façon à ce qu’il n’y ait pas de dénaturation de la protéine et que la stabilité du complexe entre effecteur et partenaire soit au maximum. De plus, le pH et la force ionique sont aussi prédéfinis pour éviter une interaction entre le support et les partenaires d’affinités.
La température quant à elle, joue un rôle dans la durée de la complexation ; plus la température est basse, plus le temps de complexation sera long.
== Applications ==
*CCM : gel adsorbant (cellulose, silice) coulé sur une plaque (verre, aluminium, plastique) mélangé à un liant (« plâtre »).
Il y a différents révélateurs (afin de voir la hauteur de migration des substances sur la plaque) pour la CCM :
**bleu de molybdène (zinzidane) : taches bleues sur les phospholipides,
**ninhydrine : taches violettes sur les amines et acides aminés,
**rhodamine : taches fluorescentes sur les lipides ;
*chromatographie sur colonne : utilisation d'un gel adsorbant sur une colonne ouverte ou fermée en [[chromatographie en phase gazeuse]] ou [[HPLC|Chromatographie en phase liquide à haute performance]].
== Voir aussi ==
La chromatographie d’affinité a été utilisée :
* Le phénomène d'[[adsorption|absorption]]
- en [[enzymologie]], pour l’extraction d’enzymes et la purification d’extraits enzymatiques ;
- en [[immunologie]], pour la purification d’anticorps ;
- en [[biochimie]], pour l’isolement des protéines et des acides nucléiques.
=== Isolement des protéines et des antigènes ===
Pour isoler des protéines de nombreuses sortes de molécules peuvent être utilisées comme ligand.
Les anticorps sont des ligands très efficaces pour isoler leur antigène spécifique, il s'agit de l'immunoaffinité. L'interaction entre un antigène et son anticorps est très forte, les constantes de dissociation (''Kd'') de l'ordre 10<sup>-10</sup>M ne sont pas rares. Le défi dans ces chromatographies est de détacher l'antigène sans l'endommager et, si possible, sans endommager la colonne et l'anticorps qui lui est attaché. Il faut donc employer des conditions douces de détergents (Triton, Tween).
Les ligands d'une enzyme peuvent être un cofacteur non hydrolysable de cette enzyme, ou encore un analogue structurel non hydrolysable du substrat.
De plus, certains colorants ont une affinité inattendue pour certaines protéines. Ainsi, le bleu de dextran peut se fixer de façon réversible à certaines kinases tandis que le bleu de procion a une affinité pour des déshydrogénases utilisant le NAD comme cofacteur.
=== Isolement d'acides nucléiques ===
Les ARNm polyadénylés peuvent facilement être isolés par chromatographie sur des résine d'oligo(dT)-cellulose ou de poly(U)-Sepharose. En effet, à forte force ionique, la courte séquence de polyadénines au bout 3' des ARNm peut se lier par simple complémentarité de base à des séquences de d'oligo-désoxythymidine ou de poly-uridine. Il faut ensuite désorber à faible force ionique.
== Références ==
http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm consulté le 23/05/2011
http://www.chimie-biochimie.umoncton.ca/bch/dg/siitub/chraffinite.html consulter le 24 avril 2011
Jean-Pierre SINE,"Séparation et analyse des biomolécules",ellipses, technosup,2003,2-7298-1729-8,pages 108 à 115
Cl.Audigié, G.Dupont, F.Zonszain ,"Principes des méthodes d'analyse biochimique" Tome 1,Doin, Biosciences et techniques, 1995,2-7040-0747-0, pages 67 à 71.
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