Patch-clamp: відмінності між версіями

 

 

 

== Мета ==

'''Транспортери''' — це білки, які утворюють з речовинами, що переносяться, комплекс з одного боку мембрани; після чого міняють конформацію так, що речовина, яка транспортується, опиняється по іншу сторону мембрани, і там її звільняють. Зазначимо, що найважливіший транспортер в клітинах [[еукаріоти|еукаріот]] — це натрієво-калієва помпа, яка активно переносить за цикл своєї роботи 3 іони [[натрій|Na]]⁺ з клітини та 2 іони [[калій|K]]⁺ в клітину, використовуючи енергію [[АТФ]]. Одна молекула цього транспортеру виконує приблизно 10³ циклів за [[секунда|секунду]].

 

 

Далі, за наявності такого каналу і потоку іонів крізь нього, буде переноситися і заряд — тобто виникати електричний струм, який можна вимірювати. Провідність одиночного каналу у відкритому стані коливається, в залежності від типу каналу, від 1-2 до 30-50 піко[[сименс]]ів, тому при різниці потенціалів в 100 мВ спостерігається струм в декілька піко[[ампер]]ів.

 

== Робота з методом та його варіанти ==

 

=== Cell-attached mode ===

 

=== Inside-out mode ===

Однак, якщо піпетку швидким рухом відірвати від клітини, то, якщо пощастить, «внутрішній» шматок мембрани відірветься від клітини і утвориться конфігурація inside-out (через те, що внутрішня, зазвичай обернена до цитоплазми, сторона мембрани опиниться ззовні, в омиваючому [[розчин]]і; а зовнішня — всередині піпетки (зображення на рисунку 3)).

 

 

=== Whole-cell mode ===

Якщо є необхідність здійснювати зміну складу позаклітинного середовища, можна не відводити піпетку від клітини, а подати в неї негативний тиск і зруйнувати ізольований шматочок мембрани, перейшовши таким чином в whole-cell mode (див. рисунок 4). Теперь піпетка з'єднана з внутрішньоклітинним середовищем. Оскільки об'єм клітини зазвичай набагато менший за об'єм піпетки, то, завдяки [[дифузія|дифузії]], склад внутрішньоклітинного середовища невдовзі виявляється ідентичним складу розчину, що в піпетці. Тому ми, як і в попередньому випадку, знаємо як склад всіх рідин, так і різницю потенціалів. До речі, якщо в конфігурації inside-out піпеточний електрод був позаклітинним, а внутрішній — внутрішньоклітинним, то тепер їхні ролі помінялись, так що задаючи потенціал, потрібно інвертувати полярність. Перевага цього методу полягає в тому, що тут виявляються збереженими всі клітинні структури і регуляторні механізми. Але є й недолік — ми вимірюємо весь сумарний струм всіх каналів у клітині, а щойно раділи потужності методу, що дозволяє спостерігати поведінку окремої молекули. Як же ж бути? В цьому випадку використовується наступна модифікація методу, що називається outside-out mode.

 

 

В наступну мить трубка порветься, а мембрана стулиться на піпетці у «виверутому» вигляді — ми опинимося в кофігурації outside-out (рисунок 6).

На цьому рисунку видно, що піпетка і її електрод — подібно кофігурації whole-cell — внутрішньоклітинні. Ми вільно міняємо склад внутрішньоклітинного розчину; площа мембрани, яку ми досліджуємо, невелика, так що ми знову маємо змогу досліджувати одиночні канали.

 

 

=== Perforated patch ===

 

 

== Електричні параметри, що фіксуються ==

=== Voltage-clamp ===

Voltage-clamp, або фіксація потенціалу, використовується при вивченні змін провідності однотипних каналів у відповідь на якісь хімічні впливи або ж залежність їхньої провідності від різниці потенціалів на мембрані, при цьому, за умови фіксації потенціалу, вимірюється струм каналу — як ми досі і описували. Приклад запису, який при цьому можна отримати, наведено на рисунку 8. Це запис одиночного каналу [[гліциновий рецептор|гліцинового рецептора]]. Чітко видно два стани: закритий (йому відповідає нульовий струм, верхнє положення) та відкритий (йому відповідає струм приблизно в 7 пікоампер, нижнє положення). Вгорі — дані, отримувані безпосередньо в досліді; внизу — ті ж дані після фільтрації електричного шуму з частотою 50 [[Герц|Гц]]. Канал час від часу довільно переходить з одного стану в інший, проміжних станів нема. Запис дозволяє отримати дві найважливіші характеристики каналу: провідність (виходячи з величин трансмембранного потенціалу і струму) та [[імовірність]] знаходження у відкритому стані, що визначається як відношення часу, коли канал відкритий до часу, коли він закритий. До речі, частіше всього активність каналу фізіологічно регулюється саме шляхом зміни цієї імовірності.

 

=== Current-clamp ===

Іноді дослідника цікавлять процеси трансмембранного переносу іонів, що пов'язані із зміною мембранного потенціалу — наприклад, проведення нервового імпульсу. В таких випадках можна вчинити навпаки: зафіксувати на постійному рівні струм (наприклад, можна припустити, що сумарний струм через всі іонні канали в кожний момент часу дорівнює нулю, тобто встановити нульовий струм) та вивчати при цьому зміну різниці потенціалів. Такий варіант називається current clamp. Приклад даних, які при цьому можна отримати, наведено на рисунку 10.

На рисунку — запис в конфігурації whole-cell, клітина епітелію збірної ниркової трубки. Трансмембранний потенціал −60 мВ. З інтервалами в 1 хвилину на 30 секунд в розчин, що омиває клітину, вводиться амілорид — інгібітор епітеліального натрієвого каналу. До речі, чутливість до інгібіторів — ще одна з найважливіших характеристик каналу. Введення амілориду щоразу призводить до падіння струму до нуля, що свідчить про те, що практично вся провідність при −60 мВ в даній клітині — це провідність епітеліального натрієвого каналу. В протилежність попередньому запису, зміна струму виглядає неперервною. Це пов'язано з тим, що одночасно записується багато каналів (близько 2000), відповідно, маємо приблизно 2000 рівнів струму — від «всі відкриті» до «всі закриті».

 

== Див. також ==

* B.Sakmann, E.Neher. Single-channel recording. (1995)