Patch-clamp: відмінності між версіями
[неперевірена версія] | [перевірена версія] |
Вилучено вміст Додано вміст
м робот додав: bg:Patch clamp |
Виправлено джерел: 1; позначено як недійсні: 0.) #IABot (v2.0.8.7 |
||
(Не показані 45 проміжних версій 27 користувачів) | |||
Рядок 1:
[[Файл:Блок-схема-Patch-Clamp.png|міні|255x255пкс|Блок-схема одного з методів [[Patch-clamp]]]]
'''Patch-clamp''' (метод локальної фіксації [[різниця потенціалів|потенціалу]] [[
Суть методу полягає в наступному: у [[Клітина|клітину]] вводяться два [[Електрод|електроди]], ще один — електрод порівняння — залишається поза клітиною. Перший внутрішньоклітинний електрод служить для вимірювання трансмембранної [[Різниця потенціалів|різниці потенціалів]] (тобто різниці потенціалів між ним і електродом порівняння), другий може подавати струм. Використання одного і того ж електрода для подачі [[Електричний струм|струму]] і вимірювання різниці потенціалів неможливо. Справа в тому, що такий електрод має вхідний електричний опір близько , що можна порівняти з опором клітинної мембрани, тому, якщо через систему «електрод-клітина» тече струм, то падіння напруги на електроді виявиться порівняним з падінням напруги на мембрані, при чому не існує способу виділити ці дві частини.
Гігантська аналітична потужність цього методу полягає в тому, що він дозволяє спостерігати за поведінкою і хімічними перетвореннями окремих [[молекула|молекул]]. Різні модифікації методу дозволяють в експерименті міняти різноманітні — а в сумі практично всі, що цікавлять — фактори, які здатні впливати на поведінку іонних каналів.▼
Далі, спеціальний пристрій — генератор сигналу — задає командний потенціал, яким повинен бути рівний трансмембранний потенціал. Виміряний трансмембранний потенціал подається на вхід пристрою порівняння, яке віднімає обмірюваний потенціал з командного і, в залежності від величини різниці, подає струм на струмовий електрод так, щоб компенсувати цю різницю. Монітор струму, в свою чергу, постійно вимірює величину струму, яка для цього необхідна.
== Історія впровадження ==▼
В [[1981]] році німецькі дослідники E.Neher і B.Sakmann виявили, що якщо [[скло|скляною]] піпеткою з діаметром 1-2 мікрони доторкнутися до клітинної мембрани, то між ними утворюється контакт з опором в декілька гіга[[Ом]], причому такий контакт виявляється механічно досить міцним. В подальшому ми такий контакт будемо називати ''gigaseal'' (прийнята в підручниках назва — ''високоомний контакт''). Якщо таку піпетку наповнити розчином електроліту і занурити туди [[хлор]]-[[срібло|срібний]] електрод, інший електрод занурити в розчин, який омиває клітину, а між ними поставити обладнання, яке буде задавати певну різницю потенціалів між електродами та вимірювати струм, який для цього необхідний, то ми отримаємо patch-clamp установку.▼
▲Гігантська аналітична потужність цього методу полягає в тому, що він дозволяє спостерігати за поведінкою і хімічними перетвореннями окремих [[молекула|молекул]]. Різні модифікації методу дозволяють в експерименті
▲В [[1981]] році німецькі дослідники
== Мета ==
[[
Головною метою методу є дослідження трансмембранних іонних потоків ([[Електричний струм|струмів]]). Живі клітини оточені мембраною, структурну основу якої складає подвійний шар [[ліпіди|ліпідів]],
'''Транспортери''' — це білки, які утворюють з речовинами, що переносяться, комплекс з одного боку мембрани; після чого міняють конформацію так, що речовина, яка транспортується, опиняється по іншу сторону мембрани, і там її
'''[[Іонні канали|Канали]]''' — це білки, які формують пори в мембрані. Однак радіус і розподіл заряджених функціональних груп в цих порах такі, що вони селективні, тобто проникні тільки для певних іонів. Зокрема, розрізняють [[
Далі, за наявності такого каналу і потоку іонів крізь нього, буде переноситися і заряд — тобто виникати електричний струм, який можна вимірювати. Провідність одиночного каналу у відкритому стані коливається, в залежності від типу каналу, від 1-2 до 30-50 піко[[сименс]]ів, тому при різниці потенціалів в 100 мВ спостерігається струм в декілька піко[[ампер]]ів.
== Робота з методом та його варіанти ==
[[
=== Cell-attached mode ===
На рисунку 1 зображена частина установки для patch-clamp. Величезна сфера, частину якої видно на моніторі в центрі фотографії — це клітина ([[ооцит]] [[жаби]] ''Xenopus laevis''), що знаходиться
Але цій конфігурації притаманні дві незручності.
По-перше, вона не дозволяє з достатньою надійністю вимірювати (а тим більше — задавати) трансмембранну різницю потенціалів, оскільки обидва електроди, як піпетковий, так і зовнішній, знаходяться з одного боку мембрани. Хоча можливо, використавши омиваючий розчин з іонною композицією, який відтворює склад цитоплазми, деполяризувати
Через це cell-attached mode застосовується доволі обмежено.
=== Inside-out mode ===
[[
Однак, якщо піпетку швидким рухом відірвати від клітини, то, якщо пощастить, «внутрішній» шматок мембрани
Альтернативнй метод переходу в inside-out конфігурацію полягає в наступному: з конфігурації cell-attached піпетку відводять плавно, формуючи з двох сторін закриту [[везикула|везикулу]]; потім піднімають піпетку в [[повітря]] і опускають в іншу ванночку з внутрішньоклітинним розчином. При переносі зовнішня мембрана везикули руйнується, в результаті утворюється конфігурація inside-out.
Тепер різниця потенціалів на фрагменті мембрани точно дорівнює різниці потенціалів між електродами. Очевидно, що при використанні такої модифікації піпетку
=== Whole-cell mode ===
[[
Якщо є необхідність здійснювати зміну складу позаклітинного середовища, можна не відводити піпетку від клітини, а подати в неї негативний тиск і зруйнувати ізольований шматочок мембрани, перейшовши таким чином в whole-cell mode (див. рисунок 4). Теперь піпетка з'єднана з внутрішньоклітинним середовищем. Оскільки об'єм клітини зазвичай набагато менший за об'єм піпетки, то, завдяки [[дифузія|дифузії]], склад внутрішньоклітинного середовища невдовзі виявляється ідентичним складу розчину, що в піпетці. Тому ми, як і в попередньому випадку, знаємо як склад всіх рідин, так і різницю потенціалів. До речі, якщо в конфігурації inside-out піпеточний електрод був позаклітинним, а внутрішній — внутрішньоклітинним, то тепер їхні ролі помінялись, так що задаючи потенціал, потрібно інвертувати полярність. Перевага цього методу полягає в тому, що тут виявляються збереженими всі клітинні структури і регуляторні механізми. Але є й недолік — ми вимірюємо весь сумарний струм всіх каналів у клітині, а
=== Outside-out mode ===
[[
Виявляється, якщо після переходу в whole-cell mode повільно відводити піпетку від клітини, мембрана не відривається одразу, а починає втягуватись в трубку.
Наступна фаза процесу зображена на рисунку 5. Мембранна трубка стала зовсім тоненька і майже невидима («протуберанець» біля поверхні клітини — це невелика частина цитоплазми, яка залишилась в мембранній трубці). До речі, зверніть увагу — в піпетці виразно видно шматочки цитоплазми, що
В наступну мить трубка порветься, а мембрана стулиться на піпетці у «виверутому» вигляді — ми опинимося в кофігурації outside-out (рисунок 6).
[[
На цьому рисунку видно, що піпетка і її електрод — подібно кофігурації whole-cell — внутрішньоклітинні. Ми вільно міняємо склад внутрішньоклітинного розчину; площа мембрани, яку ми досліджуємо, невелика, так що ми знову маємо змогу досліджувати одиночні канали.
===
Цікавий різновид patch-clamp — nuclear patch (фіксування потенціалу з клітинним ядром). Цей метод засосовується у
[[
В результаті утворюється сецифічний варіант outside-out patch, при якому до кінця піпетки приєднується значно більша, в порівнянні зі звичайним варіантом, ділянка мембрани, що обернена навколо клітинного ядра. Таким чином, імовірність знаходження потрібного одиничного рецептора на відірваному шматку мембрани помітно зростає.
=== Perforated patch ===
Perforated patch — це специфічний варіант patch-clamp в whole-cell mode. В цьому випадку після формування гігаомного контакту в піпетку подається новий розчин, який містить невелику кількість спеціального [[антибіотики|антибіотику]], наприклад Амфоторецину-В або Граміцидину. [[Антибіотики]] цього класу утворюють отвори в клітинній мембрані на ділянці, що приєднана до електроду. Такий підхід дозволяє уникнути заміщення внутрішнього середовища клітини розчином з піпетки-електроду, тобто клітина залишається живою та перебуває в максимально можливо неушкодженому вигляді. Таким чином, відповіді клітини на подразнення є максимально наближеними до
По-перше, порівняно з класичним whole-cell mode, [[електричний опір]] доступу (що складається із опору піпетки та опору з'єднання піпетка-клітина) є значно вищим. Це знижує ступінь розрізнення [[електричний струм|електричного струму]], підвищує електричний шум при записі
== Електричні параметри, що фіксуються ==
=== Voltage-clamp ===
[[
Voltage-clamp, або фіксація потенціалу, використовується при вивченні змін провідності однотипних каналів у відповідь на якісь хімічні впливи або ж залежність їхньої провідності від різниці потенціалів на мембрані, при цьому, за умови фіксації потенціалу, вимірюється струм каналу — як ми досі і описували. Приклад запису,
=== Current-clamp ===
Іноді дослідника цікавлять процеси трансмембранного переносу іонів, що пов'язані із зміною мембранного потенціалу — наприклад, проведення нервового імпульсу. В таких випадках можна вчинити навпаки: зафіксувати на постійному рівні струм (наприклад, можна припустити, що сумарний струм через всі іонні канали в
На рисунку — запис в конфігурації whole-cell, клітина епітелію збірної ниркової трубки. Трансмембранний потенціал −60 мВ. З інтервалами в 1 хвилину на 30 секунд в розчин, що омиває клітину, вводиться амілорид — інгібітор епітеліального натрієвого каналу. До речі, чутливість до інгібіторів — ще одна з найважливіших характеристик каналу. Введення амілориду щоразу призводить до падіння струму до нуля, що свідчить про те, що практично вся провідність при −60 мВ в даній клітині — це провідність епітеліального натрієвого каналу. В протилежність попередньому запису, зміна струму виглядає неперервною. Це пов'язано з тим, що одночасно записується багато каналів (близько 2000), відповідно, маємо приблизно 2000 рівнів струму — від «всі відкриті» до «всі закриті».
==
* [http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/me.html Витримки з: D.C. Ogden. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook.(1994)] {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20050228031153/http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/me.html |date=28 лютого 2005 }}
* B.Sakmann, E.Neher. Single-channel recording. (1995)
[[Категорія:Електрофізіологія]]
[[Категорія:Лабораторні методи]]
[[Категорія:
|