Patch-clamp: відмінності між версіями
[неперевірена версія] | [перевірена версія] |
Вилучено вміст Додано вміст
м Робот: хорошая статья ru:Метод локальной фиксации потенциала |
Виправлено джерел: 1; позначено як недійсні: 0.) #IABot (v2.0.8.7 |
||
(Не показані 37 проміжних версій 24 користувачів) | |||
Рядок 1:
[[Файл:Блок-схема-Patch-Clamp.png|міні|255x255пкс|Блок-схема одного з методів [[Patch-clamp]]]]
'''Patch-clamp''' (метод локальної фіксації [[різниця потенціалів|потенціалу]] [[
Суть методу полягає в наступному: у [[Клітина|клітину]] вводяться два [[Електрод|електроди]], ще один — електрод порівняння — залишається поза клітиною. Перший внутрішньоклітинний електрод служить для вимірювання трансмембранної [[Різниця потенціалів|різниці потенціалів]] (тобто різниці потенціалів між ним і електродом порівняння), другий може подавати струм. Використання одного і того ж електрода для подачі [[Електричний струм|струму]] і вимірювання різниці потенціалів неможливо. Справа в тому, що такий електрод має вхідний електричний опір близько , що можна порівняти з опором клітинної мембрани, тому, якщо через систему «електрод-клітина» тече струм, то падіння напруги на електроді виявиться порівняним з падінням напруги на мембрані, при чому не існує способу виділити ці дві частини.
Гігантська аналітична потужність цього методу полягає в тому, що він дозволяє спостерігати за поведінкою і хімічними перетвореннями окремих [[молекула|молекул]]. Різні модифікації методу дозволяють в експерименті змінювати різноманітні — а в сумі практично всі, що цікавлять — фактори, які здатні впливати на поведінку іонних каналів.▼
Далі, спеціальний пристрій — генератор сигналу — задає командний потенціал, яким повинен бути рівний трансмембранний потенціал. Виміряний трансмембранний потенціал подається на вхід пристрою порівняння, яке віднімає обмірюваний потенціал з командного і, в залежності від величини різниці, подає струм на струмовий електрод так, щоб компенсувати цю різницю. Монітор струму, в свою чергу, постійно вимірює величину струму, яка для цього необхідна.
== Історія впровадження ==▼
В [[1981]] році німецькі дослідники E.Neher і B.Sakmann виявили, що якщо [[скло|скляною]] піпеткою з діаметром 1-2 мікрони доторкнутися до клітинної мембрани, то між ними утворюється контакт з опором в декілька гіга[[Ом]], причому такий контакт виявляється механічно досить міцним. В подальшому ми такий контакт будемо називати ''gigaseal'' (прийнята в підручниках назва — ''високоомний контакт''). Якщо таку піпетку наповнити розчином електроліту і занурити туди [[хлор]]-[[срібло|срібний]] електрод, інший електрод занурити в розчин, який омиває клітину, а між ними поставити обладнання, яке буде задавати певну різницю потенціалів між електродами та вимірювати струм, який для цього необхідний, то ми отримаємо patch-clamp установку.▼
▲Гігантська аналітична потужність цього методу полягає в тому, що він дозволяє спостерігати за поведінкою і хімічними перетвореннями окремих [[молекула|молекул]]. Різні модифікації методу дозволяють в експерименті змінювати різноманітні
▲В [[1981]] році німецькі дослідники
== Мета ==
[[
Головною метою методу є дослідження трансмембранних іонних потоків ([[Електричний струм|струмів]]). Живі клітини оточені мембраною, структурну основу якої складає подвійний шар [[ліпіди|ліпідів]], слабо проникний для [[вода|води]] і практично непроникний для іонів невеликого [[радіус]]у. Однак клітина має обмінюватись цими речовинами з
'''Транспортери''' — це білки, які утворюють з речовинами, що переносяться, комплекс з одного боку мембрани; після чого міняють конформацію так, що речовина, яка транспортується, опиняється по іншу сторону мембрани, і там її звільняють. Зазначимо, що найважливіший транспортер в клітинах [[еукаріоти|еукаріот]] — це натрієво-калієва помпа, яка активно переносить за цикл своєї роботи 3 іони [[натрій|Na]]<sup>+</sup> з клітини та 2 іони [[калій|K]]<sup>+</sup> в клітину, використовуючи енергію [[АТФ]]. Одна молекула цього транспортеру виконує приблизно 10<sup>3</sup> циклів за [[секунда|секунду]].
'''[[Іонні канали|Канали]]''' — це білки, які формують пори в мембрані. Однак радіус і розподіл заряджених функціональних груп в цих порах такі, що вони селективні, тобто проникні тільки для певних іонів. Зокрема, розрізняють [[
Далі, за наявності такого каналу і потоку іонів крізь нього, буде переноситися і заряд — тобто виникати електричний струм, який можна вимірювати. Провідність одиночного каналу у відкритому стані коливається, в залежності від типу каналу, від 1-2 до 30-50 піко[[сименс]]ів, тому при різниці потенціалів в 100 мВ спостерігається струм в декілька піко[[ампер]]ів.
== Робота з методом та його варіанти ==
[[
=== Cell-attached mode ===
На рисунку 1 зображена частина установки для patch-clamp. Величезна сфера, частину якої видно на моніторі в центрі фотографії — це клітина ([[ооцит]] [[жаби]] ''Xenopus laevis''), що знаходиться
Але цій конфігурації притаманні дві незручності.
По-перше, вона не дозволяє з достатньою надійністю вимірювати (а тим більше — задавати) трансмембранну різницю потенціалів, оскільки обидва електроди, як піпетковий, так і зовнішній, знаходяться з одного боку мембрани. Хоча можливо, використавши омиваючий розчин з іонною композицією, який відтворює склад цитоплазми, деполяризувати
Через це cell-attached mode застосовується доволі обмежено.
=== Inside-out mode ===
[[
Однак, якщо піпетку швидким рухом відірвати від клітини, то, якщо пощастить, «внутрішній» шматок мембрани
Альтернативнй метод переходу в inside-out конфігурацію полягає в наступному: з конфігурації cell-attached піпетку відводять плавно, формуючи з двох сторін закриту [[везикула|везикулу]]; потім піднімають піпетку в [[повітря]] і опускають в іншу ванночку з внутрішньоклітинним розчином. При переносі зовнішня мембрана везикули руйнується, в результаті утворюється конфігурація inside-out.
Тепер різниця потенціалів на фрагменті мембрани точно дорівнює різниці потенціалів між електродами. Очевидно, що при використанні такої модифікації піпетку
=== Whole-cell mode ===
[[
Якщо є необхідність здійснювати зміну складу позаклітинного середовища, можна не відводити піпетку від клітини, а подати в неї негативний тиск і зруйнувати ізольований шматочок мембрани, перейшовши таким чином в whole-cell mode (див. рисунок 4). Теперь піпетка з'єднана з внутрішньоклітинним середовищем. Оскільки об'єм клітини зазвичай набагато менший за об'єм піпетки, то, завдяки [[дифузія|дифузії]], склад внутрішньоклітинного середовища невдовзі виявляється ідентичним складу розчину, що в піпетці. Тому ми, як і в попередньому випадку, знаємо як склад всіх рідин, так і різницю потенціалів. До речі, якщо в конфігурації inside-out піпеточний електрод був позаклітинним, а внутрішній — внутрішньоклітинним, то тепер їхні ролі помінялись, так що задаючи потенціал, потрібно інвертувати полярність. Перевага цього методу полягає в тому, що тут виявляються збереженими всі клітинні структури і регуляторні механізми. Але є й недолік — ми вимірюємо весь сумарний струм всіх каналів у клітині, а щойно раділи потужності методу, що дозволяє спостерігати поведінку окремої молекули. Як же ж бути? В цьому випадку використовується наступна модифікація методу, що називається outside-out mode.
=== Outside-out mode ===
[[
Виявляється, якщо після переходу в whole-cell mode повільно відводити піпетку від клітини, мембрана не відривається одразу, а починає втягуватись в трубку.
Рядок 47 ⟶ 51:
В наступну мить трубка порветься, а мембрана стулиться на піпетці у «виверутому» вигляді — ми опинимося в кофігурації outside-out (рисунок 6).
[[
На цьому рисунку видно, що піпетка і її електрод — подібно кофігурації whole-cell — внутрішньоклітинні. Ми вільно міняємо склад внутрішньоклітинного розчину; площа мембрани, яку ми досліджуємо, невелика, так що ми знову маємо змогу досліджувати одиночні канали.
=== Nucleated patch ===
Цікавий різновид patch-clamp — nuclear patch (фіксування потенціалу з клітинним ядром). Цей метод засосовується у випадках, коли досліджувані об'єкти (рецептори або транспортери) мають великі та критично важливі для функціонування структури на внутрішньому боці мембрани, які руйнуються в конфігурації outside-out patch (наприклад, такі структури характерні для метаботропних рецепторів). Також метою даного методу може бути збільшення [[імовірність|імовірності]] потрапляння одиничного рецептора на піпетку шляхом збільшення площі ділянки мембрани, що відривається (у випадку, коли загальна кількість досліджуваних рецепторів на клітині низька). Сам метод полягає в наступному: піпетка підводиться до клітини і потім ривком пробиває мембрану. Пілся чого кінчик піпетки підводиться до клітинного ядра і, шляхом подачі на піпетку невеликого негативного тиску, присмоктується до нього. Потім піпетка з ядром на кінці плавно виводиться назад і виймається з клітини. Виведення піпетки з клітини необхідно провести таким чином, щоб ділянка мембрани в місці виходу «надяглась» на присмоктане ядро і відірвалась, обернувшись навколо нього (див. рисунок 7).
[[
В результаті утворюється сецифічний варіант outside-out patch, при якому до кінця піпетки приєднується значно більша, в порівнянні зі звичайним варіантом, ділянка мембрани, що обернена навколо клітинного ядра. Таким чином, імовірність знаходження потрібного одиничного рецептора на відірваному шматку мембрани помітно зростає.
=== Perforated patch ===
Perforated patch — це специфічний варіант patch-clamp в whole-cell mode. В цьому випадку після формування гігаомного контакту в піпетку подається новий розчин, який містить невелику кількість спеціального [[антибіотики|антибіотику]], наприклад Амфоторецину-В або Граміцидину. [[Антибіотики]] цього класу утворюють отвори в клітинній мембрані на ділянці, що приєднана до електроду. Такий підхід дозволяє уникнути заміщення внутрішнього середовища клітини розчином з піпетки-електроду, тобто клітина залишається живою та перебуває в максимально можливо неушкодженому вигляді. Таким чином, відповіді клітини на подразнення є максимально наближеними до
По-перше, порівняно з класичним whole-cell mode, [[електричний опір]] доступу (що складається із опору піпетки та опору з'єднання піпетка-клітина) є значно вищим. Це знижує ступінь розрізнення [[електричний струм|електричного струму]], підвищує електричний шум при записі та збільшує всі помилки, що виникають завдяки флуктуаціям опору повного
== Електричні параметри, що фіксуються ==
=== Voltage-clamp ===
[[
Voltage-clamp, або фіксація потенціалу, використовується при вивченні змін провідності однотипних каналів у відповідь на якісь хімічні впливи або ж залежність їхньої провідності від різниці потенціалів на мембрані, при цьому, за умови фіксації потенціалу, вимірюється струм каналу — як ми досі і описували. Приклад запису, який при цьому можна отримати, наведено на рисунку 8. Це запис одиночного каналу [[гліциновий рецептор|гліцинового рецептора]]. Чітко видно два стани: закритий (йому відповідає нульовий струм, верхнє положення) та відкритий (йому відповідає струм приблизно в 7 пікоампер, нижнє положення). Вгорі — дані, отримувані безпосередньо в досліді; внизу — ті ж дані після фільтрації електричного шуму з частотою 50 [[Герц|Гц]]. Канал час від часу довільно переходить з одного стану в інший, проміжних станів нема. Запис дозволяє отримати дві найважливіші характеристики каналу: провідність (виходячи з величин трансмембранного потенціалу і струму) та [[імовірність]] знаходження у відкритому стані, що визначається як відношення часу, коли канал відкритий до часу, коли він закритий. До речі, частіше всього активність каналу фізіологічно регулюється саме шляхом зміни цієї імовірності.
=== Current-clamp ===
Іноді дослідника цікавлять процеси трансмембранного переносу іонів, що пов'язані із зміною мембранного потенціалу — наприклад, проведення нервового імпульсу. В таких випадках можна вчинити навпаки: зафіксувати на постійному рівні струм (наприклад, можна припустити, що сумарний струм через всі іонні канали в кожний момент часу дорівнює нулю, тобто встановити нульовий струм) та вивчати при цьому зміну різниці потенціалів. Такий варіант називається current clamp. Приклад даних, які при цьому можна отримати, наведено на рисунку 10.
На рисунку — запис в конфігурації whole-cell, клітина епітелію збірної ниркової трубки. Трансмембранний потенціал −60 мВ. З інтервалами в 1 хвилину на 30 секунд в розчин, що омиває клітину, вводиться амілорид — інгібітор епітеліального натрієвого каналу. До речі, чутливість до інгібіторів — ще одна з найважливіших характеристик каналу. Введення амілориду щоразу призводить до падіння струму до нуля, що свідчить про те, що практично вся провідність при −60 мВ в даній клітині — це провідність епітеліального натрієвого каналу. В протилежність попередньому запису, зміна струму виглядає неперервною. Це пов'язано з тим, що одночасно записується багато каналів (близько 2000), відповідно, маємо приблизно 2000 рівнів струму — від «всі відкриті» до «всі закриті».
==
* [http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/me.html Витримки з: D.C. Ogden. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook.(1994)] {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20050228031153/http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/me.html |date=28 лютого 2005 }}
* B.Sakmann, E.Neher. Single-channel recording. (1995)
[[Категорія:Електрофізіологія]]
[[Категорія:Лабораторні методи]]
[[Категорія:
|