Patch-clamp: відмінності між версіями

Гігантська аналітична потужність цього методу полягає в тому, що він дозволяє спостерігати за поведінкою і хімічними перетвореннями окремих [[молекула|молекул]]. Різні модифікації методу дозволяють в експерименті міняти різноманітні  — а в сумі практично всі, що цікавлять  — фактори, які здатні впливати на поведінку іонних каналів.

В [[1981]] році німецькі дослідники E.Neher і B.Sakmann виявили, що якщо [[скло|скляною]] піпеткою з діаметром 1-2 мікрони доторкнутися до клітинної мембрани, то між ними утворюється контакт з опором в декілька гіга[[Ом]], причому такий контакт виявляється механічно досить міцним. В подальшому ми такий контакт будемо називати ''gigaseal'' (прийнята в підручниках назва  — ''високоомний контакт''). Якщо таку піпетку наповнити розчином електроліту і занурити туди [[хлор]]-[[срібло|срібний]] електрод, інший електрод занурити в розчин, який омиває клітину, а між ними поставити обладнання, яке буде задавати певну різницю потенціалів між електродами та вимірювати струм, який для цього необхідний, то ми отримаємо patch-clamp установку.

Головною метою методу є дослідження трансмембранних іонних потоків ([[Електричний струм|струмів]]). Живі клітини оточені мембраною, структурну основу якої складає подвійний шар [[ліпіди|ліпідів]], який слабо проникний для [[вода|води]] і практично непроникний для іонів невеликого [[радіус|радіусу]]. Однак клітина має обмінюватись цими речовинами з зовнішім середовищем. Крім того, трансмембранні іонні потоки важливі для процесів збудження клітини та передачі сигналів. Ці потоки здійснюються через вбудовані в мембрану [[білок|білки]]  — канали та транспортери.

'''Транспортери'''  — це білки, які утворюють з речовинами, що переносяться, комплекс з одного боку мембрани; після чого міняють конформацію так, що речовина, яка транспортується, опиняється по іншу сторону мембрани, і там її звільнюють. Зазначимо, що найважливіший транспортер в клітинах [[еукаріоти|еукаріот]]  — це натрієво-калієва помпа, яка активно переносить за цикл своєї роботи 3 іони [[натрій|Na]]⁺ з клітини та 2 іони [[калій|K]]⁺ в клітину, використовуючи енергію [[АТФ]]. Одна молекула цього транспортеру виконує приблизно 10³ циклів за [[секунда|секунду]].

'''Канали'''  — це білки, які формують пори в мембрані. Однак радіус і розподіл заряджених функціональних груп в цих порах такі, що вони селективні, тобто проникні тільки для певних іонів. Зокрема, розрізняють [[натрій|натрієві]], [[калій|калієві]], [[кальцій|кальцієві]], а також [[хлор|хлорні]] канали. Насправді, для кожного з цих іонів існує багато різноманітних різновидів каналів (докладніше див. в статті «[[Рецептор]]»). Через одиночний канал за секунду проходить в типовому випадку 10⁶  — 10⁷ іонів.

Далі, за наявності такого каналу і потоку іонів крізь нього, буде переноситися і заряд  — тобто виникати електричний струм, який можна вимірювати. Провідність одиночного каналу у відкритому стані коливається, в залежності від типу каналу, від 1-2 до 30-50 піко[[сименс]]ів, тому при різниці потенціалів в 100 мВ спостерігається струм в декілька піко[[ампер]]ів.

На рисунку 1 зображена частина установки для patch-clamp. Величезна сфера, частину якої видно на моніторі в центрі фотографії  — це клітина ([[ооцит]] [[жаби]] ''Xenopus laevis''), що знаходиться на даний момент на предметному столику [[мікроскоп|мікроскопа]], до нього підведена patch-піпетка, діаметр якої біля носика складає близько 3 мікрони. Після встановлення gigaseal вона ізолює фрагмент мембрани [[діаметр|діаметром]] близько 3 мкм², і, якщо в цьому фрагменті трапляться іонні канали, то їхній струм можна буде записувати. Щойно описана конфігурація називається cell-attached patch-clamp. Вона ілюструється cхемою, що зображена на рисунку 2.

По-перше, вона не дозволяє з достатньою надійністю вимірювати (а тим більше  — задавати) трансмембранну різницю потенціалів, оскільки обидва електроди, як піпетковий, так і зовнішній, знаходяться з одного боку мембрани. Хоча можливо, використавши омиваючий розчин з іонною композицією, який відтворює склад цитоплазми, деполяризувати мемрану поза піпеткою так, що різниця потенціалів між зовнішнім електродом і цитоплазмою зникне. Тоді різниця потенціалів між електродами виявиться рівною трансмембранному потенціалу, однак це досить приблизно, оскільки точний склад цитоплазми є невідомим. По-друге, ця конфігурація не дозволяє міняти склад середовища поза піпеткою.

Однак, якщо піпетку швидким рухом відірвати від клітини, то, якщо пощастить, «внутрішній» шматок мембрани відрветься від клітини і утвориться конфігурація inside-out (через те, що внутрішня, зазвичай обернена до цитоплазми, сторона мембрани опиниться ззовні, в омиваючому [[розчин|розчині]]; а зовнішня  — всередині піпетки (зображення на рисунку 3).

Якщо є необхідність здійснювати зміну складу позаклітинного середовища, можна не відводити піпетку від клітини, а подати в неї негативний тиск і зруйнувати ізольований шматочок мембрани, перейшовши таким чином в whole-cell mode (див. рисунок 4). Теперь піпетка з'єднана з внутрішньоклітинним середовищем. Оскільки об'єм клітини зазвичай набагато менший за об'єм піпетки, то, завдяки [[дифузія|дифузії]], склад внутрішньоклітинного середовища невдовзі виявляється ідентичним складу розчину, що в піпетці. Тому ми, як і в попередньому випадку, знаємо як склад всіх рідин, так і різницю потенціалів. До речі, якщо в конфігурації inside-out піпеточний електрод був позаклітинним, а внутрішній  — внутрішньоклітинним, то тепер їхні ролі помінялись, так що задаючи потенціал, потрібно інвертувати полярність. Перевага цього методу полягає в тому, що тут виявляються збереженими всі клітинні структури і регуляторні механізми. Але є й недолік  — ми вимірюємо весь сумарний струм всіх каналів у клітині, а ми щойно раділи потужності метода, що дозволяє спостерігати поведінку окремої молекули. Як же ж бути? В цьому випадку використовується наступна модифікація методу, що називається оutside-out mode.

Наступна фаза процесу зображена на рисунку 5. Мембранна трубка стала зовсім тоненька і майже невидима («протуберанець» біля поверхні клітини  — це невелика частина цитоплазми, яка залишилась в мембранній трубці). До речі, зверніть увагу  — в піпетці виразно видно шматочки цитоплазми, що попали туди після руйнування мембрани при переході в whole-cell.

В наступну мить трубка порветься, а мембрана стулиться на піпетці у «виверутому» вигляді  — ми опинимося в кофігурації outside-out (рисунок 6).

На цьому рисунку видно, що піпетка і її електрод  — подібно кофігурації whole-cell  — внутрішньоклітинні. Ми вільно міняємо склад внутрішньоклітинного розчину; площа мембрани, яку ми досліджуємо, невелика, так що ми знову маємо змогу досліджувати одиночні канали.

Цікавий різновид patch-clamp  — nuclear patch (фіксування потенціалу з клітинним ядром). Цей метод засосовується у випадку, коли на поверхні мембрани є тільки невелика кількість каналів, що досліджується. Основною метою даного методу є збільшення [[імовірність|імовірності]] потрапляння одиничного рецептора на піпетку шляхом збільшення площі ділянки мембрани, що відривається. Сам метод полягає в наступному: піпетка підводиться до клітини і потім ривком пробиває мембрану. Пілся чого кінчик піпетки підводиться до клітинного ядра і, шляхом подачі на піпетку невеликого негативного тиску, присмоктується до нього. Потім піпетка з ядром на кінці плавно виводиться назад і виймається з клітини. Виведення піпетки з клітини необхідно провести таким чином, щоб ділянка мембрани в місці виходу «надяглась» на присмоктане ядро і відірвалась, обернувшись навколо нього (див. рисунок 7).

Perforated patch  — це специфічний варіант patch-clamp в whole-cell mode. В цьому випадку після формування гігаомного контакту в піпетку подається новий розчин, який містить невелику кількість спеціального [[антибіотики|антибіотику]], наприклад Амфоторецину-В або Граміцидину. [[Антибіотики]] цього класу утворюють отвори в клітинній мембрані на ділянці, що приєднана до електроду. Такий підхід дозволяє уникнути заміщення внутрішнього середовища клітини розчином з піпетки-електроду, тобто клітина залишається живою та перебуває в максимально можливо неушкодженому вигляді. Таким чином, відповіді клітини на подразнення є максимально наближеними до природніх. Але даному методу притаманий і ряд недоліків.

Voltage-clamp, або фіксація потенціалу, використовується при вивченні змін провідності однотипних каналів у відповідь на якісь хімічні впливи або ж залежність їхньої провідності від різниці потенціалів на мембрані, при цьому, за умови фіксації потенціалу, вимірюється струм каналу  — як ми досі і описували. Приклад запису, що при цьому можна отримати, наведено на рисунку 8. Це запис одиночного каналу [[гліциновий рецептор|гліцинового рецептору]]. Чітко видно два стани: закритий (йому відповідає нульовий струм, верхнє положення) та відкритий (йому відповідає струм приблизно в 7 пікоампер, нижнє положення). Вверху  — дані, отримувані безпосередньо в досліді; внизу  — ті ж дані після фільтрації електричного шуму з частотою 50 [[Герц|Гц]]. Канал час від часу довільно переходить з одного стану в інший, проміжних станів нема. Запис дозволяє отримати дві найважливіші характеристики каналу: провідність (виходячи з величин трансмембранного потенціалу і струму) та [[імовірність]] знаходження у відкритому стані, що визначається як відношення часу, коли канал відкритий до часу, коли він закритий. До речі, частіше всього активність каналу фізіологічно регулюється саме шляхом зміни цієї імовірності.

Іноді дослідника цікавлять процеси трансмембранного переносу іонів, що пов'язані із зміною мембранного потенціалу  — наприклад, проведення нервового імпульсу. В таких випадках можна вчинити навпаки: зафіксувати на постійному рівні струм (наприклад, можна припустити, що сумарний струм через всі іонні канали в кожен момент часу дорівнює нулю, тобто встановити нульовий струм), та вивчати при цьому зміну різниці потенціалів. Такий варіант називається current clamp. Приклад даних, що при цьому можна отримати, наведено на рисунку 10.

На рисунку  — запис в конфігурації whole-cell, клітина епітелію збірної ниркової трубки. Трансмембранний потенціал −60 мВ. З інтервалами в 1 хвилину на 30 секунд в розчин, що омиває клітину, вводиться амілорид  — інгібітор епітеліального натрієвого каналу. До речі, чутливість до інгібіторів  — ще одна з найважливіших характеристик каналу. Введення амілориду щоразу призводить до падіння струму до нуля, що свідчить про те, що практично вся провідність при −60 мВ в даній клітині  — це провідність епітеліального натрієвого каналу. В протилежність попередньому запису, зміна струму виглядає неперервною. Це пов'язано з тим, що одночасно записується багато каналів (близько 2000), відповідно, маємо приблизно 2000 рівнів струму  — від «всі відкриті» до «всі закриті».